結(jié)晶紫法檢測TNF的生物活性

　　TNF包括TNFα與TNFß兩型，它們具有極其相似的生物學(xué)活性，在體內(nèi)外可對一些腫瘤細胞或細胞系起殺傷作用，而對正常細胞則無細胞毒效應(yīng)。根據(jù)這一特點，可利用TNF對敏感靶細胞的細胞毒效應(yīng)，在體外檢測TNF的活性水平，既可檢測分泌型TNF(sTNF)，也可檢測膜結(jié)合型TNF(mTNF)。最常用的方法是體外檢測TNF對小鼠成纖維瘤細胞(L929細胞)的細胞毒效應(yīng)。

　　【基本原理】

　　TNF對L929細胞有細胞毒作用，如同時加用轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D，則可提高L929細胞對TNF的敏感性10～100倍。利用染料結(jié)晶紫或MTT可使活細胞染色，再用脫色液將染料脫出，測定其OD值，即可反應(yīng)細胞的存活狀態(tài)或TNF對L929細胞的殺傷率，通過計算細胞死亡率，并與sTNF標(biāo)準品對照，即可檢測待測樣品sTNF活性單位。

　　【材料和試劑】

　　(1)L929細胞株(存活率應(yīng)>95%)

　　(2)TNF標(biāo)準品：作倍比稀釋(100U/ml～0.1U/ml)。

　　(3)待測樣品：作倍比稀釋至少6個不同稀釋度。

　　(4)0.25%胰蛋白酶

　　(5)RPMI-1640培養(yǎng)液及PBS

　　(6)0.25%結(jié)晶紫(溶于20%甲醇中)，或者5mg/mlMTT(溶于PBS中)

　　(7)放線菌素D(分存液濃度為100ug/ml)

　　(8)檸檬酸鈉緩沖液(0.9%檸檬酸鈉，0.02mol/L鹽酸，47.5%乙醇，為脫色液);酸化異丙醇(0.04mol/LHCL異丙醇)

　　(9)96孔細胞培養(yǎng)板，刻度吸管，毛細吸管，加樣器(頭)，刻度離心管，離心機，細胞計數(shù)板，倒置顯微鏡，超凈工作臺，CO2培養(yǎng)箱。

　　(10)酶標(biāo)測定儀，570nm濾光片，630nm濾光片。

　　【操作步驟】

　　(1)取對數(shù)生長期的L929細胞，用0.25%胰蛋白酶消化2-3min，然后洗滌細胞2次，以去除消化液及原生長培養(yǎng)液;

　　(2)用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)L929細胞濃度為2×105/ml;

　　(3)將上述細胞懸液加至96孔培養(yǎng)板，100ul/孔;

　　(4)置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;

　　(5)吸去細胞培養(yǎng)上清液后，各孔分別加入倍比稀釋的標(biāo)準品和待測樣品，100ul/孔，各設(shè)雙復(fù)孔，并設(shè)培養(yǎng)液陰性對照及空白對照(即L929細胞、標(biāo)準品及待測樣品均不加入，僅加培養(yǎng)液);

　　(6)同時向各孔均加入10ul放線菌素D(0.5～1μg/孔);

　　(7)置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-14h;

　　(8)甩棄上清，并用RPMI-1640培養(yǎng)液洗細胞1次;

　　(9)每孔均加入0.25%結(jié)晶紫，100μl/孔，室溫下染色10min;

　　(10)甩棄上清，再用PBS洗板3次;

　　(11)室溫下涼干，加入檸檬酸鈉緩沖液脫色，100μl/孔;

　　(12)充分混勻后，用酶標(biāo)儀以檢測波長570nm，參考波長630nm測各孔OD值。