流式細(xì)胞實驗常見問題解答

　　流式細(xì)胞實驗的對照應(yīng)該如何設(shè)置?什么是同型對照?

　　答：①在應(yīng)用流式技術(shù)檢測細(xì)胞表面抗原時，我們通常要設(shè)的一個對照就是同型對照。

　　同型對照：使用與熒光標(biāo)記抗體相同來源、相同標(biāo)記、相同劑量和亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面而產(chǎn)生的背景染色。

　�、诩�(xì)胞因子的流式檢測時，由于細(xì)胞經(jīng)過了培養(yǎng)刺激活化的處理，為保證測得結(jié)果的準(zhǔn)確性和客觀性，除了同型對照外，還需另設(shè)置未刺激對照和刺激對照。

　　未刺激對照：激活時由于BFA等的存在抑制了胞內(nèi)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，因此在激活過程中產(chǎn)生的抗原與細(xì)胞因子會滯留胞內(nèi)，未刺激對照也應(yīng)包含BFA等阻斷劑。

　　激活對照：激活對照使用細(xì)胞表面表達(dá)CD69來評價激活與否，如果未達(dá)到CD69期望的水平，則激活步驟出了問題，某一試劑可能失活，過期，制備不當(dāng)或溶劑污染，需制備新鮮刺激劑重新實驗。

　　間接免疫熒光標(biāo)記法如何設(shè)置同型對照?

　　答：同型對照的目的是消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面而產(chǎn)生的背景染色，而確保檢測結(jié)果的真實性。在采用間接免疫熒光標(biāo)記法流式檢測時，所設(shè)的同型對照是與一抗相同劑量、相同亞型和相同生物素標(biāo)記(或純化)免疫球蛋白，之后的熒光標(biāo)記過程與實驗檢測組相同即可。

　　為什么流式細(xì)胞術(shù)多色分析時要進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)整?

　　答：在進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)多色分析時,待測細(xì)胞通常攜帶兩種或兩種以上的熒光素,如異硫氰熒光素(FITC)、藻紅蛋白(PE)、別藻紅蛋白(PECY5)等。這些熒光素被激光激發(fā)后發(fā)出不同波長的熒光,理論上每一種熒光通過選擇恰當(dāng)?shù)臑V光片可被相應(yīng)的檢測器檢測到,而不受其他熒光的干擾。但目前這些熒光染料都具有寬發(fā)射譜性質(zhì),盡管它們的發(fā)射峰各不相同,但發(fā)射譜范圍有一定的重疊,也就是說,相鄰的檢測器會檢測到彼此的熒光信號,例如,FITC檢測器會檢測到少量的PE光譜,而PE檢測器會檢測到較多的FITC光譜。這樣就影響了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,因此,多色分析時必須進(jìn)行光譜重疊的校正。

　　如何檢測胞內(nèi)因子抗體的特異性?

　　答：可以應(yīng)用過量的相應(yīng)細(xì)胞因子先封閉該胞內(nèi)因子的熒光標(biāo)記抗體，或者先用不帶熒光標(biāo)記的相應(yīng)因子抗體先封閉細(xì)胞，進(jìn)一步流式操作作對照;另外同型對照也可以判斷細(xì)胞的固定、破膜的效果以及非特異性背景的影響。

　　為什么用CD45αSSC設(shè)門法進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)白血病表型分析?

　　答:免疫分型所用的樣本通常是骨髓,由于骨髓中各種大小和分化程度的細(xì)胞均有,只根據(jù)細(xì)胞大小和顆粒密度很難將不同組分的細(xì)胞區(qū)分開。而造血系統(tǒng)細(xì)胞的CD45表達(dá)的熒光強(qiáng)度(FI)與細(xì)胞分化程度有一定關(guān)系,即分化程度高的成熟白細(xì)胞其CD45的FI也高,分化程度低的細(xì)胞其FI也低,而紅系細(xì)胞的FI最低。在成熟白細(xì)胞中,各類細(xì)胞其CD45的FI亦不相同,其中淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的FI高于中性粒細(xì)胞。因此,根據(jù)各類細(xì)胞CD45的FI和顆粒密度不同,采用CD452SSC(側(cè)向角散射)設(shè)門法可以將原始細(xì)胞(低FI,低或高SSC)、淋巴細(xì)胞(高FI,低SSC)、單核細(xì)胞(高FI,中等SSC)、中性粒細(xì)胞(低FI,高SSC)、紅系細(xì)胞(最低FI,低或高SSC)和細(xì)胞碎片(最低FI,最低SSC)清楚地區(qū)分開。