結(jié)核分枝桿菌分子菌種鑒

　　①PCR菌種鑒定法。用各種分枝桿菌特異性引物對標本DNA進行一系列PCR擴增或多重PCR擴增，根據(jù)擴增產(chǎn)物所產(chǎn)生的特異性片段進行鑒定;或先用分枝桿菌屬特異的外部引物擴增，然后再用菌種特異的內(nèi)部引物進行巢氏擴增鑒定。該法靈敏、快速，但目前能夠鑒定的菌種尚不多，主要有MT、牛分枝桿菌、MT復(fù)合群、鳥分枝桿菌、副結(jié)核分枝桿菌和麻風分枝桿菌。

　�、赑CR-直接測序鑒定法。用分枝桿菌屬特異的引物對標本的16SrRNA或65ku抗原基因進行PCR擴增，然后直接測定擴增產(chǎn)物的核苷酸序列，比較其核苷酸的差異來鑒定菌種。但該方法無法鑒別少數(shù)分枝桿菌，而且技術(shù)要求高，需昂貴的特殊儀器，而難以推廣。

　�、跴CR-DNA探針鑒定法：用分枝桿菌屬特異的引物對標本中分枝桿菌16S或16S一23SrDNA進行擴增，然后與各種分枝桿菌特異的寡核苷酸探針進行反向斑點雜交或微孔板反向雜交鑒定菌種。該法較靈敏、快速，但目前只能鑒定部分菌種。

　�、躊CR-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)鑒定法。PCR-RFLP菌種鑒定法是以分枝桿菌屬特異性引物對標本中分枝桿菌6Sku蛋白編碼基因、16S或16-23SrDNA進行擴增，然后用不同的限制性內(nèi)切酶消化擴增片段，通過電泳分析酶切圖譜來鑒定菌種。目前只能鑒定部分菌種，重復(fù)性還不夠理想。

　　祖燕、張國龍等以DR為基礎(chǔ)的Spoligo typing DNA指紋方法參照“SPOLIGO TYPlNG”一書。合成43種特異的DR間隔區(qū)短核苷酸序列，并將它們依次按順序固化于Bio-dyneC膜(PallBiosupport公司)上，一般按膜大小固化數(shù)十排，以便可以同時完成多個臨床標本的Spoligotyping鑒定工作。然后用新鮮配制的16%的EDAC(Sigma公司)溶液激活固化好的生物膜，將生物膜裝置于Miniblotter MN45中待用。

　　PCR擴增結(jié)核分枝桿菌基因組DNA上的重復(fù)元件DR之間的序列，引物為

　　DRa：5’-GGTTTTGGGTCTGACGAC-3’

　　DRb：5’-CCGAGAGGGGACGGAAAC-3’

　　且DRa 5’末端標記有生物素。將PCR產(chǎn)物置于固定在MiniblotterMN45中的BiodyneC膜上，增強化學發(fā)光試劑盒使之雜交、顯色，結(jié)果即為結(jié)核分枝桿菌Spoligotyping的DNA指紋圖譜。

　　⑤PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR SSCP)初步菌種鑒定法。PCR-SSCP技術(shù)是目前最廣泛應(yīng)用的一種根據(jù)單鏈DNA構(gòu)象差別快速、靈敏地檢測基因變異的方法。由于16SrRNA 123～275位核苷酸是分枝桿菌屬高度變異的區(qū)域，不同種分枝桿菌DNA單鏈的空間構(gòu)象不同，電泳后片段的遷移率也就不同，從而呈現(xiàn)出不同的圖譜，最終建立了新的PCR-SSCP分枝桿菌分子菌種鑒定方法。應(yīng)用該方法能夠鑒別MT復(fù)合群和NTM，NTM菌種之間的鑒別尚在研究之中。

　　⑥PCR-基因芯片鑒定法�；�因芯片技術(shù)是指將大量核酸分子以預(yù)先設(shè)計的方式固定在載體上，檢測帶標記的待測樣品DNA，是一種大規(guī)模分析遺傳差異的新方法。目前少數(shù)實驗室利用分枝桿菌16S rRNA或rpoB基因某些位置上的分枝桿菌屬或種特異的核苷酸變化，研究通過雜交測序鑒定分枝桿菌菌種。