維生素 D 測定法

　　精密稱取供試品適量(相當于維生素 D 總量 600 單位以上，重量不超過 2.0g)，置皂化瓶中，加乙醇 30ml、抗壞血酸 0.2g 與 50%(g/g)氫氧化鉀溶液 3ml[若供試量為 3g，則加 50%(g/g)氫氧化鉀溶液 4ml]，置水浴上加熱回流 30 分鐘，冷卻后，自冷凝管頂端加水 10ml 沖洗冷凝管內(nèi)壁，將皂化液移至分液漏斗中，皂化瓶用水 60～100ml 分數(shù)次洗滌，洗液并入分液漏斗中，用不含過氧化物的乙醚

　　振搖提取 3 次，第一次 60ml，以后每次 40ml，合并乙醚液，用水洗滌數(shù)次，每次約 100ml，洗滌時應緩緩旋動，避免乳化，直至水層遇酚酞指示液不再顯紅色，靜置，分取乙醚提取液，加入干燥濾紙條少許振搖除去乙醚提取液中殘留的水分，分液漏斗及濾紙條再用少量乙醚洗滌，洗液與提取液合并，置具塞圓底燒瓶中，在水浴上低溫蒸發(fā)至約 5ml，再用氮氣流吹干，迅速精密加入甲醇 3ml，密塞，超聲處理助溶后，移入離心管中，離心，取上清液作為供試品溶液 A。

　　凈化用色譜柱系統(tǒng)分離收集維生素 D 精密量取上述供試品溶液 A 500ml，注入以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的液相色譜柱，以甲醇-乙腈-水(50:50:2)為流動相進行分離，檢測波長為 254nm，從計錄儀上觀察色譜圖，要求維生素 D 與前維生素 D 為疊峰，并能與維生素 A 及其他干擾含量測定的雜質(zhì)分開;準確 收集含有維生素 D 及前維生素 D 混合物的全部流出液，置具塞圓底燒瓶中，用氮氣流迅速吹干,精密加入正己烷溶液適量使每 1ml 中含維生素 D 為 50～140 單位，密塞，超聲處理助溶，即為供試品溶液 B。取供試品溶液 B，按第一法進行含量測定，進樣量為 100～200ml。