典型PCR操作程序與優(yōu)化方法

一、試劑
（1）引物根據(jù)待擴(kuò)增DNA不同，引物亦不同。
（2）耐熱DNA聚合酶：此酶是從耐熱細(xì)菌中分離出來的，能耐受高溫（93~100℃）。
（3）10x PCR緩沖液：500mm01／LKCl； 100mmol／LTris-HCl（pH8.4，20c），150mmol／LMgCl2，lmg／m1明膠。
（4）5mmo1／LdNTP貯備液：將dATP，dCTP，dGTPT和dTTP鈉鹽各100mg合并，加3m1滅菌去離子水溶解，用NaOH調(diào)pH至中性，分裝每份300v1，-20℃保存，dNTP濃度最好用uv吸收法精確測定。
（5）標(biāo)本處理試劑：不同標(biāo)本所需試劑不同，根據(jù)具體情況而定。

二、操作程序
利用PCR擴(kuò)增的操作程序基本相同，只是根據(jù)引物與靶序列的不同，選擇不同的反應(yīng)體系與循環(huán)參數(shù)，基本的操作是將PCR必需反應(yīng)成分加入一微量離心管中，然后置于一定的循環(huán)參數(shù)條件下進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增。每個實(shí)驗(yàn)室或每個人都有不同的操作習(xí)慣，但需遵守一定的操作規(guī)范。推薦下述操作程序，因這樣操作可最大程度地增加反應(yīng)的成功率。
（1）向一微量離心管中依次加入：
ddH2O補(bǔ)至終體積（終體積50~100ul）
10xPCR緩沖液1／10體積
dNTP各200umol／L
引物各1umol／L
DNA模板
混勻后，離心15s使反應(yīng)成分集于管底。
（2）加石蠟油50~100ul于反應(yīng)液表面以防蒸發(fā)。置反應(yīng)管于97c變性7min（染色體DNA）或5min（質(zhì)粒DNA）。
（3）冷至延伸溫度時，加入1~5UTaqDNA聚合酶，在此溫度作用1min。
（4）于變性溫度下使模板DNA變性適當(dāng)時間。
（5）在復(fù)性溫度下使引物與模板雜交一定時間。
（6）在延伸溫度下使復(fù)性的引物延伸合適的時間。
（7）重復(fù)（4）~（6）步25~30次。每次即為一個PCR循環(huán)。
（8）微量瓊脂德凝膠電泳檢查擴(kuò)增產(chǎn)物。