如何在現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗室中應(yīng)用超微量分光度計

如何在現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗室中應(yīng)用超微量分光光度計

核酸的定量是超微量分光光度計最常用的功能。寡脫氧核苷酸、單鏈DNA、雙鏈DNA和RNA可溶于緩沖液中，

可定量溶解.核酸最高吸收峰的吸收波長為260nm。各核酸的分子組成不同，其轉(zhuǎn)化率也不同。為了量化不同類型的核酸，

應(yīng)事先選擇相應(yīng)的系數(shù)。例如，1OD的吸光度值分別與單鏈DNA、40μg/ml的50μg/ml、37μg/ml和30μg/ml的50μg/ml的吸光度值相當(dāng)。

測試后，用上述系數(shù)換算吸光度值，得到相應(yīng)的樣品濃度。在試驗前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋劑的體積，

然后測試空白液體和樣品液體。然而，實驗并非一帆風(fēng)順。閱讀不穩(wěn)定可能是實驗者最頭疼的問題。儀器靈敏度越高，吸收值漂移越大。

事實上，超微量分光光度計的設(shè)計原理和工作原理允許吸光度值在一定范圍內(nèi)變化，也就是說，儀器具有一定的準(zhǔn)確度和準(zhǔn)確度。

此外，還需要考慮核酸的物理化學(xué)性質(zhì)和溶解核酸緩沖液的pH值、離子濃度等因素：在實驗中，離子濃度過高，也會導(dǎo)致讀數(shù)漂移。

因此，在一定的pH值和較低的離子濃度(如TE)的緩沖液中，可以很好地穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度也是一個不容忽視的因素：

因為樣品中不可避免地含有一些細(xì)小的顆粒，特別是核酸樣品。這些小顆粒的存在會干擾測試效果。

為了盡量減少粒子對測試結(jié)果的影響，要求核酸的吸光度值至少為0。1A，吸光度值優(yōu)于0。1≤1.5A.在此范圍內(nèi)，粒子的干擾相對較小，結(jié)果穩(wěn)定。

這意味著樣品的濃度不應(yīng)太低或過高(超過光度計的測試范圍)。最后，操作因素，如充分混合，否則吸收值太低，

甚至是負(fù)值；混合物不能有氣泡，空白液體中不存在懸浮物，否則讀數(shù)漂移強(qiáng)烈；

必須使用相同的比色杯來測試空白液體和樣品，否則濃度差太大；轉(zhuǎn)換系數(shù)與樣品濃縮單元選擇相同；

不能使用窗口磨損的比色杯；樣品的體積必須滿足比色杯所要求的最小體積等。

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